Новая методика позволяет проводить прямую трансляцию жизни бактерий



На панели А изображена схема использованного прибора: растворитель подается по капилляру, находящемуся под высоким напряжением, к поверхности образца; оттуда капля жидкости всасывается в находящийся под вакуумом вход масс-спектрометра. На панели Б приведена фотография капилляров в момент соприкосновения с поверхностью растущей на чашке Петри бактериальной колонии. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Новые методы масс-спектрометрии и анализа данных позволяют пронаблюдать за жизнью бактериальной колонии «в прямом эфире». Ученые надеются, что подобные технологии облегчат поиск и изучение новых биологически активных веществ, в том числе представляющих интерес для медицины, а также откроют путь к изучению взаимодействия бактерий в природе.

В бытность свою студентом университета автор этих строк наивно предполагал, что бактерии устроены просто и о жизни, например, модельного организма Escherichia coli мы знаем практически всё, изучать больше нечего — почему бы не сконструировать искусственную жизнь на его основе? В дальнейшем автор осознал, что глубоко ошибался: оказалось, что кишечная палочка устроена гораздо, гораздо сложнее, чем он думал, а наши знания всё еще бесконечно далеки от полного понимания или воспроизведения происходящего в клетке. Чего стоит один только факт, что треть генов E. coli по-прежнему кодирует «белки с неизвестной функцией».

Поток геномных данных, обрушившийся на биологов в последнее десятилетие, позволил предположить, что многие из этих «неизвестных» могут относиться к обширной, но плохо изученной области межклеточных взаимодействий бактерий. Сообщества бактерий устроены не проще, чем многоклеточный организм: каждая из клеток взаимодействует с соседями и координирует свое поведение с помощью многочисленных и разнообразных химических сигналов. Большинство важных для человека процессов, например развитие бактериальной инфекции, являются результатом работы сообщества бактерий, а не просто собрания индивидуальных клеток.

Оказалось, что в геномах прокариот содержатся тысячи неохактеризованных генов, отвечающих за синтез всевозможных вторичных метаболитов, включая потенциальные антибиотики. К сожалению, исследование этих веществ, равно как и изучение «микробной экологии», пока что является тяжелой задачей. Процесс идентификации идет очень медленно — каждое вещество нужно долго и кропотливо изучать, по очереди «выбивая» гены его биосинтеза. Дополнительные трудности создает «неуловимость» многих сигнальных веществ — они производятся в узких временных рамках, в ответ на специфические стимулы — например, присутствие конкурентов, изменение температуры или содержания тех или иных питательных веществ. Многие метаболиты продуцируются только при росте бактерий на твердых средах, и в этом случае набор применимых методов для анализа еще более сужается.

Группа профессора Доррештейна из Калифорнийского университета в Сан-Диего последние годы занимается применением масс-спектрометрии для решения подобных задач.

Масс-спектрометрияэто физический метод анализа, получивший в последние годы широкое распространение в биологии. Масс-спектрометр измеряет отношение массы иона к его заряду. Обычно приобретаемый в процессе ионизации заряд известен, что позволяет определить массу индивидуального иона с фантастически высокой точностью (впрочем, к сожалению, недостижимой в биологических приложениях). Важнейшие различия между режимами масс-спектрометрии связаны со способом ионизации молекул: это либо испарение кристаллов вещества с твердой проводящей подложки лазером (matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI), либо более щадящая ионизация при образовании микроскопических заряженных капель жидкости на конце капилляра, к которому приложено высокое напряжение (electrospray desorption ionization, ESI).

Первые попытки были связаны с применением MALDI-анализа: при этом бактериальные колонии выращивались на тонком слое агара непосредственно на поверхности металлической подложки для MALDI. После этого колонию покрывали слоем матрицы (вещества, облегчающего процесс кристаллизации и ионизации) с помощью специального распылителя и сканировали ее поверхность лазером, снимая спектр во множестве отдельных точек. Таким образом удавалось создать двумерную картину распределения веществ по поверхности колонии. К сожалению, в MALDI ионизация очень сильно зависит от способности вещества образовывать кристаллы и протонироваться (приобретать положительный заряд), причем хорошо акцептирующие протон молекулы способны подавлять протонирование других. Это ведет к тому, что реально присутствующие в образце вещества могут быть не детектированы. Кроме того, трудно говорить о сохранении природного состояния клетки, когда ее поверхность покрыта слоем ароматических кислот, обычно применяемых в качестве матрицы.

В статье, вышедшей не так давно в журнале PNAS, коллектив авторов под руководством Питера Доррештейна предлагает новый подход к тотальному анализу секретируемых бактериями веществ. На этот раз исследователи использовали разновидность ESI–ионизации под названием «nanoDESI» (Nanospray desorption-electrospray ionization). В системе nano-DESI заряженная капля растворителя удерживается между концами двух капилляров: исходящего капилляра от насоса (например, ВЭЖХ-насоса), к которому прикладывается высокое напряжение, и капилляра, ведущего ко входу в детектор масс-спектрометра (ионную ловушку). Содержащиеся на поверхности образца вещества растворяются в капле и под действием вакуума засасываются в ловушку, по ходу движения превращаясь в ионы.

Систему капилляров можно подвести к бактериальной колонии в любом интересном месте и мгновенно получить «снимок» всех находящихся поверхности клеток веществ, растворяющихся в данном растворителе (например, в воде с метанолом). Разные растворители позволяют экстрагировать разные типы веществ, тем самым облегчая их идентификацию. Пожалуй, этот метод является самым «нежным» из имеющихся на данный момент в арсенале биохимиков: контакт с каплей воды никак не повреждает структуры поверхности клеток. Дополнительное удобство метода в том, что в отличие от MALDI, для ионизации не требуется проводящая металлическая подложка, и можно выращивать колонии на обычных привычных биологам чашках Петри. Посмотрев опубликованный на сайте журнала видеоролик, можно собственными глазами увидеть, как в течение секунды после контакта бактериальной колонии с каплей растворителя на экране компьютера возникают пики, соответствующие ионам разных масс.



Пример конструирования «молекулярных сетей». Спектры фрагментации сравниваются, и на основании количества общих фрагментов рассчитывается коэффициент «похожести» спектров. Если сравнить три спектра на панели С, можно увидеть, что они отличаются только отдельными химическими модификациями. На панели B приведен один из узлов сети, полученной для производимого Bacillus subtilus липопептидного антибиотика сурфактина. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Тем не менее, получить хороший спектр — это в лучшем случае половина дела. Надо еще заставить спектры «говорить», превратить набор значений масс в химические структуры отдельных веществ, находящихся в сложной смеси. Для этого в масс-спектрометрии применяется метод фрагментации — выбранный ион подвергается столкновениям с атомами нейтрального газа, например, аргона и распадается на фрагменты, масса которых измеряется. Отличия между фрагментами соответствуют массам отдельных аминокислот, сахаров, или других остатков в составе исходного вещества и позволяют установить его строение. Для того, чтобы интерпретировать огромный массив данных, полученный в результате анализа поверхности колоний, и идентифицировать отдельные вещества, ученые обратились к методу конструирования сетей, давно известному в геномных исследованиях, но ранее не применявшемуся в масс-спектрометрии.

Для этого для всех индивидуальных ионов были получены масс-спектры фрагментации. Полученные спектры были объединены в группы согласно количеству одинаковых фрагментов в них. Грубо говоря, если вещество А массой 12 распадается на фрагменты с массами 2, 4 и 6, а вещество Б с массой 11 — на фрагменты с массами 1, 4 и 6, то вещества А и Б можно отнести к одной группе и предположить, что отличие между ними заключается только в первом фрагменте. Разумеется, такого рода анализ подвержен большому количеству ошибок и его надежность зависит от количества набранной статистики и точности измерения масс. «Сетевой» метод анализа оказался на удивление продуктивным: кластеры масс-спектров фрагментации позволили не только обнаружить ранее неизвестные модификации известных веществ, но и с легкостью идентифицировать вещества, прежде старательно скрывавшиеся от исследователей, в частности, выделяемый некоторыми штаммами Pseudomonas антибиотик танамицин.

Существование танамицина было предсказано биоинформатически, предполагалось, что он помогает псевдомонадам, колонизирующим корни растений, бороться с патогенными грибами. Тем не менее, до настоящего времени традиционными биохимическими методами обнаружить танамицин не удавалось, несмотря на использование разнообразных сред и условий роста.

Группа Доррештейна сравнила масс-спектры, снятые в течение некоторого времени с колоний двух штаммов Pseudomonas: дикого типа и несущего мутацию в одном из генов, по данным биоинформатиков отвечающего за синтез танамицина. После составления сетей был найден узел, соответствующий группе родственных ионов, присутствующий только в штамме дикого типа. Анализируя спектры фрагментации, удалось расшифровать часть первичной структуры вещества, содержащего хлор и напоминающего известный токсин Pseudomonas syringae — сирингомицин. Кластер синтеза генов танамицина имеет в своем составе фермент галогеназу, отвечающий за присоединение атома хлора: таким образом, догадка биоинформатиков подтвердилась. Вероятно, танамицин производится в небольших количествах и в течение коротких промежутков времени.



Вот так выглядят реальные результаты анализа — сети, построенные по наборам спектров фрагментации из разных точек взаимодействующих колоний Streptomyces coelicolor и Bacillus subtilis. Каждая точка сети соответствует одному спектру фрагментации; происхождение спектра (дальний край колонии или взаимодействующий край) обозначено цветом. Кружками обведены группы спектров фрагментации, относящиеся к отдельным детектированным веществам (например, сурфактину B. subtilis или актинородину S. coelicolor). Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Не менее полезным новый метод оказался и в исследовании взаимодействия бактерий: посадив рядом друг с другом на чашке Петри колонию Bacillus subtilis и Streptomyces coelicolor, ученые смогли определить, как меняется состав метаболитов, производимых бактериями при контакте друг с другом. Для этого спектры, снятые со взаимодействующих краев колоний и с краев, находящихся дальше всего от конкурентов, сравнили друг с другом тем же «сетевым» методом. Результаты не только подтвердили уже известный микробиологам факт, что контакт с бациллами заставляет стрептомицетов синтезировать красный пигмент — антибиотик актинородин, но и продемонстрировали синтез во взаимодействующих клетках множества других веществ, которые только предстоит определить.

Возможно, среди них найдутся новые потенциальные антибиотики. Таким образом, микробиологи, биохимики и экологи получили в свое распоряжение новый мощный метод, позволяющий вести практически «прямую трансляцию» химической жизни бактерий. Порадуемся за них, но не будем пока загадывать, приведет ли это к революции в сфере идентификации и анализа природных соединений — увидим через несколько лет.

Источник

«Счастье дается только знающим. Чем больше знает человек, тем резче, тем сильнее он видит поэзию земли там, где ее никогда не найдет человек, обладающий скудными знаниями»

Константин Паустовский