Беседы клеток

Соседние клетки обмениваются информацией через каналы в плазматических мембранах. Нарушения в этой «переговорной системе» могут приводить к самым разным патологиям - от потери слуха до сердечно-сосудистых заболеваний.

Мы узнаем новости по телефону, через Twitter, Facebook или Linkedln. Живые клетки тоже получают информацию, и для этого у них есть масса возможностей. Одни секретируют гормоны, которые распространяются по всему телу с кровью, другие высвобождают особые вещества, передающие сигналы от одного нейрона другому. Но почти все они общаются со своими ближайшими соседями напрямую, через многочисленные каналы, соединяющие их содержимое.

Впечатляющее свидетельство такой межклеточной коммуникации было получено в середине 1960-х гг., когда в одну из тесно прилегающих друг к другу клеток ввели флуоресцирующее вещество. Глядя на клеточную массу в микроскоп, ученые увидели, что флуоресценция быстро распространяется на все большее число клеток, пока, наконец. они все не начинают светиться. Уже было известно, что ионы могут передавать электронные сигналы от одной клетки к другим, соседним. Но распространение молекул красителя, которые все же больше по размерам, чем ионы, подтвердило давнюю догадку, что в клеточных мембранах есть каналы, по которым молекулы перемещаются между соседними клетками.

Сегодня мы знаем, что такие каналы пронизывают клеточные мембраны в тканях всех животных, в том числе и человека, выполняя множество жизненно важных функций. Каналы, называемые щелевидными контактами, участвуют в синхронизации сокращений клеток сердечной мышцы и матки во время родов. Кроме того, они опосредуют адаптацию глаза к разной освещенности и даже играют свою роль в формировании органов в процессе эмбрионального развития.

Более 20 лет назад выяснилось, что нарушения в структуре или работе щелевидных контактов причастны к развитию ряда заболеваний, в частности к потере слуха, катаракте, кожным патологиям и даже некоторым видам рака. Единственная мутация, приводящая к нарушению структуры какого-нибудь важного белка щелевидного контакта между клетками внутреннего уха, может сопровождаться потерей слуха на 40%. И заболеваний аналогичной этиологии обнаруживается все больше. Некоторые из них, в частности одна из разновидностей эпилепсии у детей, выявлены в последние несколько лет.

Вникая в детали строения щелевидных контактов, мы постепенно узнаем, какие нарушения в их сборке и функционировании приводят к тому или иному заболеванию. Все это позволяет находить новые способы устранения многих расстройств, возникающих в результате утраты коммуникативных связей между клетками.



Краситель, введенный в одну из клеток в культуре (в центре), быстро распространяется по всей клеточной массе через посредство щелевидных контактов

Наведение мостов

В те времена, когда проводились первые эксперименты с введением красителя в одну из клеток ткани и наблюдени­ем за распространением флуоресценциина соседние клетки, никто не задумывался о медицинской стороне вопроса. В 1960-1970-х гг. цитологи занимались в основном поисками новых свидетельств загадочного общения соседних клеток друг с другом и выяснением деталей коммуникативных связей. Еще до обнаружения щелевидных контактов и их наименования физиологи выяснили, что обмен информацией с помощью молекул происходит в самых разных органах и у разных животных - от кальмаров и электрических рыб до человека с его широчайшим спектром клеток разного типа. Проведенные эксперименты однозначно показали, что клетки обмениваются разнообразными молекулами в местах тесного физического контакта между плазматическими мембранами.

К концу 1960-х гг. цитологии сконцентрировались на выяснении структуры каналов и их формирования. Микроскопические исследования показали, что у плазматических мембран есть плоские протяженные области, в пределах которых соседние клетки сближаются друг с другом до расстояния всего в несколько нанометров, образуя систему, которая теперь называется щелевидным контактом. Такое наименование утвердилось по­сле того, как обнаружилось, что этот узкий зазор не пустое пространство, он заполнен структурами, соединяющими клетки друг с другом.

Для того чтобы выяснить, какую роль играют эти плоские мембранные участки в межклеточной коммуникации, один из нас (Росс Джонсон) решил посмотреть, что происходит при их образовании. Вместе с коллегами из Миннесотского университета он аккуратно отделил друг от друга клетки опухоли печени, выращенные в культуре, а затем смешал их. В течение одной минуты на мембранах появились уплощенные участки - но только в местах соединения клеток. Данное наблюдение подтвердило высказанное ранее предположение, что образование щелевидного контакта происходит при сотрудничестве примыкающих друг к другу клеток. По мере расширения уплощенных участков возрастала и сила межклеточного тока, т.е. ускорялся обмен ионами.

Изолировав мембраны слипшихся клеток, что­бы рассмотреть их более прицельно, Джонсон с сотрудниками увидели некие образования, напоминающие крупные частицы, которые концентрировались в уплощенных участках. Как выяснилось позже, образования представляли собой те самые каналы - «строительные блоки» щелевидных контактов. Каждый канал образован белковыми молекулами, называемыми коннексинами. Все они
принадлежат к одному обширному семейству белков, идентифицированному в конце 1980-х гг.

Шесть молекул коннексина образуют полуканал - структуру, напоминающую по форме бублик. Он встроен в наружную мембрану клетки. Два гексамерных комплекса (полуканала) соседних клеток соединяются конец-в-конец и образуют протяженный канал, соединяющий содержимое обеих клеток. Каждый щелевой контакт представляет собой комплекс из сотен и даже тысяч каналов. Создание таких поистине грандиозных в мас­
штабах клетки коммуникативных агрегатов - трудоемкое мероприятие. Один щелевидный контакт может содержать до 10 тыс. каналов, а поскольку каждый из них состоит из двух полуканалов, образуемых шестью молекулами коннексина, для формирования контакта может потребоваться 120 тыс. подобных молекул. Сердечная мышца состоит из миллиардов клеток, и каждая из них сообщается с несколькими соседями через щелевидные контакты. Эти колоссальные конструкции - настоящее чудо молекулярной инженерии in vivo.

Что еще более удивительно, щелевидные контакты - это не раз и навсегда заданные и даже не долгоживущие конструкции, они постоянно распадаются и образуются вновь. При этом половина молекул коннексина обновляются каждые два часа. В течение суток каждый щелевидный контакт в сердечной мышце скорее всего разрушается и все его каналы заменяются новыми. Чтобы коммуникативные связи между клетками не исчезали, процессы должны быть четко скоординированы. Выяснением механизмов координации мы и занялись. В частности, мы решили выяснить, как контролируется процесс сборки и разрушения каналов.

Молекулярная застежка-молния

Мы набросали план нашего сотрудничества, попивая кофе в перерывах между докладами на конференции по щелевидным контактам, проходившей в Асиломарском конференц-центре в Пасифик­ Гров, штат Калифорния. Это было в 1991 г., один из нас (Пол Лампе) работал в лаборатории Джонсона в Миннесотском университете и занимался исследованием регуляции сборки щелевидных контактов. Последний член нашего трио (Дейл Лэрд) был постдоком в Калифорнийском технологическом институте, где только что синтезировал набор антител, специфически связывающихся с коннексинами. С помощью этих антител мы могли установить, какие участки коннексиновых молекул играют ключевую роль в образовании и функционировании щелевидного контакта.

Антитела, полученные Лэрдом, распознавали один конкретный тип коннексинов, Сх43. В геноме человека содержатся гены, кодирующие 24 разных коннексинов, и каждый тип клеток вырабатывает свой набор этих белков. Клетки кожи синтезиру­ют до девяти разных коннексинов. В организме человека наиболее распространен коннексин Сх43, он присутствует в клетках кожи, сердца, головного мозга, легких, костной ткани и многих других. Как и все прочие коннексины Сх43 состоит из четырех пронизывающих клеточную мембрану сегментов-якорей. «Хвост» молекулы, погруженный в цитоплазму, содержит набор элементов, которые, как мы выяснили позже, участвуют в регуляции активности коннексина и встраивания его в каналы. Две петли, образуемые при пересечении белком плазматической мембраны, выступают в межклеточное пространство. С некоторыми из этих внеклеточных сегментов связываются антитела Лэрда.

Разумно было предположить, что петли выполняют роль зубцов застежки-молнии, зацепляясь друг за друга и соединяя мембраны соседних клеток. Чтобы проверить данную гипотезу, мы снова разъединили контактирующие клетки, а затем смешали их, создав подходящие для воссоединения условия. только в данном случае добавили в среду антитела Лэрда. Теперь щелевидные контакты вообще не образовывались; ни межклеточного транспорта красителя, ни уплощенных участков не наблюдалось. Присоединившиеся к петлям антитела не позволяли молекулам коннексина соседних клеток соединяться друг с другом.

Исследования показали, что сцепление коннексинов играет ключевую роль в формировании щелевидных контактов. Но чтобы отследить поведение коннексинов в реальном времени, нужны были особые методы.

По следам коннексина

В 1994 г. мы - авторы этой статьи - встретились на другой конференции, проходившей в Американском обществе клеточной биологии в Сан-Франциско. Обсуждая вечерами разные научные проблемы, мы заинтересовались неким белком, флуоресцирующим в зеленой области (GFP), применение которого в качестве чрезвычайно полезного инструмента в молекулярно-биологических исследованиях принесло открывшим его ученым Нобелевскую премию. Один из докладов конференции был посвящен применению данного белка в качестве маркера для отслеживания превращений соединения, интересующего авторов, и это навело
нас на мысль прикрепить GFP к коннексину, чтобы пронаблюдать за его перемещениями.

Мы начали с того, что присоединили GFP к «хвостам» молекулы. К счастью, это не помешало им правильно встроиться в мембрану и образовать функционирующий щелевидный контакт. Так мы получили прецизионный инструмент для наблюдения за поведением коннексина. Эту работу Лэрд продолжил в Университете Западной Онтарио. Вначале мы фотографировали клетки, содержащие модифицированный коннексин, каждые десять минут. Но белок перемещался так быстро, что уследить за ним мы не успевали. Уменьше­ние интервала до двух минут тоже ничего не дало, и в конце концов мы стали делать снимки каждые несколько секунд. Так мы смогли наблюдать не только за перемещением коннексина, но и за транспортировкой полуканалов внутри клетки вдоль микротрубочек. Обнаружилось, что щелевидные контакты небольших размеров могутобъединяться, а крупные - разделяться, т.е. происходит своего рода ремоделирование контактов по мере роста клеток. во время их перемещения, деформации и деления.

Используя более изощренные методы наблюдения за поведением коннексинов, наши коллеги увидели, что щелевидные контакты увеличиваются в размерах путем присоединения полуканалов по их периметру, так что центральная часть структуры представляет собой самую "старую" ее часть. "Долгожителю", по-видимому, со временем уступают место "молодым", что объясняет, почему щелевидные контакты остаются стабильными даже при утрате части коннексинов.

В ходе экспериментов на живых клетках мы столкнулись с еще одним, пожалуй, наиболее интересным фактом: клетка подает сигнал к кластеризации щелевидных контактов, когда партнерша, по существу отделяется от нее под действием внешних воздействий (на это же указывали результаты электронно-микроскопических исследований, проведенных ранее другими учеными). Радикальный маневр мгновенно прерывает всякое взаимодействие между клетками, когда необходимость в нем отпадает. Такая масштабная элиминация щелевидных контактов происходит, например. в клетках стенки матки после родов, уничтожая коммуникационные сети, которые координируют процесс сокращения органа.

Все под контролем

Следующим нашим шагом стало выяснение механизма управления этим грандиозным событием. Согласно полученным ранее данным, в качестве регулятора здесь выступают белки под названием протеинкиназы. Присоединив фосфатную группу к белку-мишени, они изменяют его активность или локализацию в клетке. Мы поставили перед собой задачу установить, что именно происходит с молекулой коннексина при фосфорилировании. Исследования возглавил Лампе, ставший в 1994 г. заведующим лабораторией в Центре исследований онкологических заболеваний Фреда Хатчинсона в Сиэтле. Изучая шаг за шагом небольшие сегменты Сх43, Лампе с коллегами выяснили, что за время жизни этот коннексин претерпевает до 15 актов фосфорилирования в разных местах хвостовой части. Такая информация позволила нам составить что-то вроде
регуляторного кода, контролирующего образование щелевидных контактов, которые содержат Сх43. Связывание специфической протеинкиназы с определенным участком «хвоста» коннексина приводит к ускорению сборки Сх43-контактов, другие протеинкиназы, взаимодействующие с другими участками, напротив, подавляют процесс, уменьшают функциональность или размер контакта.

Располагая регуляторным кодом, мы можем тестировать различные ткани тела человека. чтобы выяснить, как изменение профиля фосфорилирования при тех или иных заболеваниях сказывается на сборке и функционировании щелевидных контактов. В сотрудничестве с другими научными коллективами мы пытаемся проследить изменение коммуникативных связей через щелевидные контакты во время преодоления клетками сердечной мышцы последствий кислородного голодания, связанного с инфарктом, или процесс мобилизации клеток кожи при заживлении раны. В обоих случаях обнаружилось повышение уровня фосфорилирования в специфической части «хвоста» Сх43, что сопровождалось кратковременным резким увеличением размера щелевидных контактов в исследованных тканях.

Это приводило к усилению межклеточных взаимодействий - что очень важно в первые минуты после травмы и способствовало сохранению функциональности клеток сердечной мышцы и миграции клеток кожи к месту повреждения. Вся эта информация открыла дорогу к разработке лекарственных средств, которые повышают или понижают активность соответствующих протеинкиназ. Правда. пользоваться данными средствами нужно с осторожностью, поскольку увеличение числа щелевидных контактов может быть полезным на одной стадии заболевания и вредным на другой. У людей, страдающих диабетом, заживление ран происходит медленно вследствие длительной выработки избыточных количеств Сх43. И когда у таких людей возникает повреждение роговицы глаза, сверхпродукция коннексинов может спровоцировать воспаление и образование рубцов вместо того чтобы ускорить заживление.

Следующие шаги на пути к практическому применению всей информации о биологии щелевидных контактов невозможны без понимания сути процессов агрегации коннексинов в различных тканях при разных условиях и выяснениях причин, по которым эти процессы нарушаются при тех или иных заболеваниях. Весьма полезными здесь могут быть генетические данные, в частности выявление мутаций в генах коннексинов.

Разрыв коммуникативных связей

Первое неопровержимое генетическое свидетельство причастности коннексинов к развитию одной из патологий появилось в середине 1990-х гг. Было показано, что мутации в гене Сх32 становятся причиной заболевания периферической нервной системы Шарко - Мари -Тута. При этой патологии в миелиновой оболочке нервных волокон исчезают щелевидные контакты, в результате чего происходят демиелинизация нервов и их деградация. Болезнь проявляется, среди прочего, слабостью и атрофией дистальных мышц ног. В дальнейшем были выявлены другие мутации в генах коннексинов, и сегодня идентифицированы 14 связанных с ними заболеваний. Помимо нейродегенеративных патологий это потеря слуха, эпилепсия, сердечно-сосудистые и кожные заболевания, катаракта и целый спектр дефектов развития. Удивительно, что если какая-то мутация затрагива­ет коннексины двух разных органов, то один из них может постра­дать, а другой нет.

Одно из возможных объяснений данного феномена состоит в том, что в некоторых тканях потерю функциональности одних коннексинов восполняют другие интактные коннексины, так что межклеточная коммуникативность остается на прежнем уровне. Такой компенсаторный механизм работает не во всех тканях. Возможен и другой вариант, один конкретный коннексин выполняет в разных тканях неодинаковые функции. Члены различных коннексиновых семейств могут взаимодействовать друг с другом, приводя к образованию гибридных каналов, которые обеспечивают распространение разных молекулярных сигналов - важных для одних органов и несущественных для других.

Однако есть коннексины, дефекты в которых сказываются на множестве разных тканей. Так, у больных с окулодентодигитальной дисплазией (ODDD), связанной с мутациями в гене Сх43, возникает широкий спектр аномалий: уменьшение размера глаз, недоразвитость зубов, деформация скелета в области головы, образование перепонок между пальцами рук и ног. А у некоторых индивидов, кроме того, образуются грубые мозоли на ладонях и подошвах стоп. Недавние исследования «жизненного цикла» коннексинов внесли некоторую ясность в вопрос различий последствия мутаций в генах коннексинов у разных людей.

У больных с ODDD в генах Сх43 обнаружено 70 мутаций, и сейчас мы выясняем, что именно происходит с соответствующими коннексинами и как это сказывается на формировании щелевидных контактов. Лэрд с коллегами обнаружил, что многие мутации приводят к тому, что коннексины, транспортируясь к клеточной мембране обычным путем, не образуют функционального щелевидного контакта, молекулы красителя не подходят к нему, а это означает, что либо канал неправильно собран, либо он не пропускает сигнальные молекулы. Так или иначе, межклеточные связи нарушаются. Другие ОDDD-мутации приводят к тому, что коннексины даже не доходят до клеточной мембраны.

У их носителей возникают еще более серьезные патологии. Это наводит на мысль, что коннексиновые полуканалы - не просто компоненты щелевидных контактов; они выполняют определенную работу, и когда она остается незавершенной, возникают более серьезные по своим медицинским последствиям проблемы. Возможно, если полуканал не связывается со своим партнером, клетки пропускают внутрь молекулы, отличные от тех, которые проходят через полноценные каналы. Такой феномен получил экспериментальное подтверждение, добавив еще один штрих к нашим представлениям о роли коннексинов в межклеточной коммуникации. Дальнейшие исследования работы полуканалов помогут идентифицировать другие мишени для лекарственных препаратов, которые могли бы облегчить состояние больных с ODDD и другими заболеваниями, обусловленными мутациями в коннексиновых генах.

Выведывание секретов

Выяснение генетических аспектов сборки и функционирования щелевидных контактов прокладывает путь к разработке высокоизбирательных лекарственных средств, противостоящих последствиям мутаций в коннексиновых генах. Зная, например. что данная мутация приводит к нарушению сборки щелевидного контакта, но не затрагивает транспорт коннексинов к поверхности клетки, можно попытаться найти вещество, которое восстанавливало бы способность коннексинов к образованию функционального канала.

Это позволило бы "реанимировать" коммуникативные связи между клетками, не прибегая к полной замене мутантного коннексина с использованием генной терапии, которая пока не вошла в повседневную медицинскую практику и сопряжена с большим риском.

Генетика не только создает предпосылки к идентификации новых мишеней для лекарственных веществ, но и служит инструментом изучения биологии щелевидных контактов. Так, мы пока недостаточно хорошо знаем, какие вещества перетекают из клетки в клетку через щелевидные контакты. В клетках сердечной мышцы это ионы, а о переносчиках сигналов в тканях слухового аппарата или в коже нам почти ничего не известно. Если мы выясним, чем различаются коннексиновые кана­лы и как нарушения их сборки и функционирования провоцируют те или иные заболевания, то сможем глубже проникнуть в тайну межклеточной коммуникации. О чем на самом деле "переговариваются") клетки и как эти "беседы" регулируют сборку и активность столь крупных систем, как щелевид­ные контакты, - вот фундаментальные вопросы, на которые нам предстоит ответить.

Авторы:

Росс Джонсон (Ross G. Johnson) - почетный профессор генетики, клеточной биологии и биологии развития Миннесотского университета. Занимается исследованием щелевидных контактов с 1960-х гг., когда эти структуры были только открыты.

Пол Лампе (Paul D. Lampe) - один из руководителей Программы трансляционных исследований; работает в отделе здравоохранения и биологии человека в Онкологическом центре Фреда Хатчинсона в Сиэтле.

Дейл Лэрд (Dale W. Laird) - профессор клеточной биологии, заведующий кафедрой щелевидных контактов Университета Западной Онтарио.

Перевод: Н.Н. Шафрановская

Источник: В мире науки [07] июль 2015 год