Новая методика позволяет проводить прямую трансляцию жизни бактерий

На панели А изображена схема использованного прибора: растворитель подается по капилляру, находящемуся под высоким напряжением, к поверхности образца; оттуда капля жидкости всасывается в находящийся под вакуумом вход масс-спектрометра. На панели Б приведена фотография капилляров в момент соприкосновения с поверхностью растущей на чашке Петри бактериальной колонии. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Новые методы масс-спектрометрии и анализа данных позволяют пронаблюдать за жизнью бактериальной колонии «в прямом эфире». Ученые надеются, что подобные технологии облегчат поиск и изучение новых биологически активных веществ, в том числе представляющих интерес для медицины, а также откроют путь к изучению взаимодействия бактерий в природе.

В бытность свою студентом университета автор этих строк наивно предполагал, что бактерии устроены просто и о жизни, например, модельного организма Escherichia coli мы знаем практически всё, изучать больше нечего — почему бы не сконструировать искусственную жизнь на его основе? В дальнейшем автор осознал, что глубоко ошибался: оказалось, что кишечная палочка устроена гораздо, гораздо сложнее, чем он думал, а наши знания всё еще бесконечно далеки от полного понимания или воспроизведения происходящего в клетке. Чего стоит один только факт, что треть генов E. coli по-прежнему кодирует «белки с неизвестной функцией».

Поток геномных данных, обрушившийся на биологов в последнее десятилетие, позволил предположить, что многие из этих «неизвестных» могут относиться к обширной, но плохо изученной области межклеточных взаимодействий бактерий. Сообщества бактерий устроены не проще, чем многоклеточный организм: каждая из клеток взаимодействует с соседями и координирует свое поведение с помощью многочисленных и разнообразных химических сигналов. Большинство важных для человека процессов, например развитие бактериальной инфекции, являются результатом работы сообщества бактерий, а не просто собрания индивидуальных клеток.

Оказалось, что в геномах прокариот содержатся тысячи неохактеризованных генов, отвечающих за синтез всевозможных вторичных метаболитов, включая потенциальные антибиотики. К сожалению, исследование этих веществ, равно как и изучение «микробной экологии», пока что является тяжелой задачей. Процесс идентификации идет очень медленно — каждое вещество нужно долго и кропотливо изучать, по очереди «выбивая» гены его биосинтеза. Дополнительные трудности создает «неуловимость» многих сигнальных веществ — они производятся в узких временных рамках, в ответ на специфические стимулы — например, присутствие конкурентов, изменение температуры или содержания тех или иных питательных веществ. Многие метаболиты продуцируются только при росте бактерий на твердых средах, и в этом случае набор применимых методов для анализа еще более сужается.

Группа профессора Доррештейна из Калифорнийского университета в Сан-Диего последние годы занимается применением масс-спектрометрии для решения подобных задач.

Масс-спектрометрия — это физический метод анализа, получивший в последние годы широкое распространение в биологии. Масс-спектрометр измеряет отношение массы иона к его заряду. Обычно приобретаемый в процессе ионизации заряд известен, что позволяет определить массу индивидуального иона с фантастически высокой точностью (впрочем, к сожалению, недостижимой в биологических приложениях). Важнейшие различия между режимами масс-спектрометрии связаны со способом ионизации молекул: это либо испарение кристаллов вещества с твердой проводящей подложки лазером (matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI), либо более щадящая ионизация при образовании микроскопических заряженных капель жидкости на конце капилляра, к которому приложено высокое напряжение (electrospray desorption ionization, ESI).

Первые попытки были связаны с применением MALDI-анализа: при этом бактериальные колонии выращивались на тонком слое агара непосредственно на поверхности металлической подложки для MALDI. После этого колонию покрывали слоем матрицы (вещества, облегчающего процесс кристаллизации и ионизации) с помощью специального распылителя и сканировали ее поверхность лазером, снимая спектр во множестве отдельных точек. Таким образом удавалось создать двумерную картину распределения веществ по поверхности колонии. К сожалению, в MALDI ионизация очень сильно зависит от способности вещества образовывать кристаллы и протонироваться (приобретать положительный заряд), причем хорошо акцептирующие протон молекулы способны подавлять протонирование других. Это ведет к тому, что реально присутствующие в образце вещества могут быть не детектированы. Кроме того, трудно говорить о сохранении природного состояния клетки, когда ее поверхность покрыта слоем ароматических кислот, обычно применяемых в качестве матрицы.

В статье, вышедшей не так давно в журнале PNAS, коллектив авторов под руководством Питера Доррештейна предлагает новый подход к тотальному анализу секретируемых бактериями веществ. На этот раз исследователи использовали разновидность ESI–ионизации под названием «nanoDESI» (Nanospray desorption-electrospray ionization). В системе nano-DESI заряженная капля растворителя удерживается между концами двух капилляров: исходящего капилляра от насоса (например, ВЭЖХ-насоса), к которому прикладывается высокое напряжение, и капилляра, ведущего ко входу в детектор масс-спектрометра (ионную ловушку). Содержащиеся на поверхности образца вещества растворяются в капле и под действием вакуума засасываются в ловушку, по ходу движения превращаясь в ионы.

Систему капилляров можно подвести к бактериальной колонии в любом интересном месте и мгновенно получить «снимок» всех находящихся поверхности клеток веществ, растворяющихся в данном растворителе (например, в воде с метанолом). Разные растворители позволяют экстрагировать разные типы веществ, тем самым облегчая их идентификацию. Пожалуй, этот метод является самым «нежным» из имеющихся на данный момент в арсенале биохимиков: контакт с каплей воды никак не повреждает структуры поверхности клеток. Дополнительное удобство метода в том, что в отличие от MALDI, для ионизации не требуется проводящая металлическая подложка, и можно выращивать колонии на обычных привычных биологам чашках Петри. Посмотрев опубликованный на сайте журнала видеоролик, можно собственными глазами увидеть, как в течение секунды после контакта бактериальной колонии с каплей растворителя на экране компьютера возникают пики, соответствующие ионам разных масс.



Пример конструирования «молекулярных сетей». Спектры фрагментации сравниваются, и на основании количества общих фрагментов рассчитывается коэффициент «похожести» спектров. Если сравнить три спектра на панели С, можно увидеть, что они отличаются только отдельными химическими модификациями. На панели B приведен один из узлов сети, полученной для производимого Bacillus subtilus липопептидного антибиотика сурфактина. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Тем не менее, получить хороший спектр — это в лучшем случае половина дела. Надо еще заставить спектры «говорить», превратить набор значений масс в химические структуры отдельных веществ, находящихся в сложной смеси. Для этого в масс-спектрометрии применяется метод фрагментации — выбранный ион подвергается столкновениям с атомами нейтрального газа, например, аргона и распадается на фрагменты, масса которых измеряется. Отличия между фрагментами соответствуют массам отдельных аминокислот, сахаров, или других остатков в составе исходного вещества и позволяют установить его строение. Для того, чтобы интерпретировать огромный массив данных, полученный в результате анализа поверхности колоний, и идентифицировать отдельные вещества, ученые обратились к методу конструирования сетей, давно известному в геномных исследованиях, но ранее не применявшемуся в масс-спектрометрии.

Для этого для всех индивидуальных ионов были получены масс-спектры фрагментации. Полученные спектры были объединены в группы согласно количеству одинаковых фрагментов в них. Грубо говоря, если вещество А массой 12 распадается на фрагменты с массами 2, 4 и 6, а вещество Б с массой 11 — на фрагменты с массами 1, 4 и 6, то вещества А и Б можно отнести к одной группе и предположить, что отличие между ними заключается только в первом фрагменте. Разумеется, такого рода анализ подвержен большому количеству ошибок и его надежность зависит от количества набранной статистики и точности измерения масс. «Сетевой» метод анализа оказался на удивление продуктивным: кластеры масс-спектров фрагментации позволили не только обнаружить ранее неизвестные модификации известных веществ, но и с легкостью идентифицировать вещества, прежде старательно скрывавшиеся от исследователей, в частности, выделяемый некоторыми штаммами Pseudomonas антибиотик танамицин.

Существование танамицина было предсказано биоинформатически, предполагалось, что он помогает псевдомонадам, колонизирующим корни растений, бороться с патогенными грибами. Тем не менее, до настоящего времени традиционными биохимическими методами обнаружить танамицин не удавалось, несмотря на использование разнообразных сред и условий роста.

Группа Доррештейна сравнила масс-спектры, снятые в течение некоторого времени с колоний двух штаммов Pseudomonas: дикого типа и несущего мутацию в одном из генов, по данным биоинформатиков отвечающего за синтез танамицина. После составления сетей был найден узел, соответствующий группе родственных ионов, присутствующий только в штамме дикого типа. Анализируя спектры фрагментации, удалось расшифровать часть первичной структуры вещества, содержащего хлор и напоминающего известный токсин Pseudomonas syringae — сирингомицин. Кластер синтеза генов танамицина имеет в своем составе фермент галогеназу, отвечающий за присоединение атома хлора: таким образом, догадка биоинформатиков подтвердилась. Вероятно, танамицин производится в небольших количествах и в течение коротких промежутков времени.



Вот так выглядят реальные результаты анализа — сети, построенные по наборам спектров фрагментации из разных точек взаимодействующих колоний Streptomyces coelicolor и Bacillus subtilis. Каждая точка сети соответствует одному спектру фрагментации; происхождение спектра (дальний край колонии или взаимодействующий край) обозначено цветом. Кружками обведены группы спектров фрагментации, относящиеся к отдельным детектированным веществам (например, сурфактину B. subtilis или актинородину S. coelicolor). Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Не менее полезным новый метод оказался и в исследовании взаимодействия бактерий: посадив рядом друг с другом на чашке Петри колонию Bacillus subtilis и Streptomyces coelicolor, ученые смогли определить, как меняется состав метаболитов, производимых бактериями при контакте друг с другом. Для этого спектры, снятые со взаимодействующих краев колоний и с краев, находящихся дальше всего от конкурентов, сравнили друг с другом тем же «сетевым» методом. Результаты не только подтвердили уже известный микробиологам факт, что контакт с бациллами заставляет стрептомицетов синтезировать красный пигмент — антибиотик актинородин, но и продемонстрировали синтез во взаимодействующих клетках множества других веществ, которые только предстоит определить.

Возможно, среди них найдутся новые потенциальные антибиотики. Таким образом, микробиологи, биохимики и экологи получили в свое распоряжение новый мощный метод, позволяющий вести практически «прямую трансляцию» химической жизни бактерий. Порадуемся за них, но не будем пока загадывать, приведет ли это к революции в сфере идентификации и анализа природных соединений — увидим через несколько лет.

Источник