Принудительная эволюция белков

 

На свете существует огромное количество белков, однако часто среди них нет тех, которые нужны для наших человеческих целей. Но благодаря открытиям нобелевских лауреатов по химии 2018 года теперь с белками можно делать в буквальном смысле что угодно. Тем удивительнее, что для таких абсолютно «неестественных» целей исследователи использовали самый что ни на есть природный механизм — эволюцию.

 

Чтобы лучше понять суть нынешней Нобелевской премии по химии, вспомним домашних кроликов. Кролики бывают разные: большие и маленькие, с короткой шерстью и с длинной, причём разных цветов, с висячими ушами... И мы примерно представляем, как они появились. Например, какой-то кроликовод захотел, чтобы у него были кролики с длинной шерстью. И вот в течение нескольких поколений он отбирал среди своих питомцев тех, у которых шерсть была чуть длиннее, чем у остальных. Хозяин таким длинношёрстным разрешал размножаться дальше, и в каждом следующем поколении отбор повторялся. Кролики размножаются быстро, и кроликовод вполне мог успеть за свою жизнь вывести новую породу с длинной шерстью.

 

Мы приблизительно описали то, что называется искусственным отбором. В дикой природе происходит то же самое, только роль кроликовода играют условия среды, в которых живёт популяция: под давлением естественного отбора в популяции остаются особи, наиболее приспособленные к окружающей обстановке. Но для отбора необходимо, чтобы было из чего выбирать, то есть кролики должны быть изменчивыми. Не нужно быть биологом, достаточно оглянуться и посмотреть вокруг — и мы увидим, что все живые организмы так или иначе отличаются друг от друга. У этой изменчивости есть разные источники. Обычно в первую очередь вспоминают про неизбежные генетические мутации, которые в той или иной мере сказываются на биохимии, физиологии, внешнем облике индивидуумов. Изменчивость плюс отбор дают нам эволюцию.

 

Какое всё это имеет отношение к Нобелевской премии по химии? Такое, что с белками можно поступать ровно так же, как с кроликами. Собственно, одна из лауреатов, профессор Калифорнийского технологического института Фрэнсис Арнольд, и получила свою часть премии с формулировкой «за направленную эволюцию ферментов».

 

Ферменты — белки, ускоряющие биохимические реакции. Без них химические реакции в живых организмах невозможны. Представим, что у нас есть фермент, который мы хотим изменить так, чтобы он работал быстрее, или в других условиях, или с другими веществами. Как это можно сделать?

 

Молекулы ферментов, как и любых других белков, — это длинные цепочки аминокислот. Аминокислоты в цепочке взаимодействуют друг с другом в соответствии с физико-химическими законами, цепочка многократно изгибается в самых разных направлениях. В результате получается трёхмерная структура, уникальная для каждого вида белка, а благодаря структуре белок приобретает уникальную функцию. Аминокислотная цепочка, многократно свернувшись, формирует активный центр фермента — то место в молекуле, где фермент может манипулировать химическими связями в других веществах-участникаххимических реакций. Изменив последовательность аминокислот, мы изменим всю структуру белка, и работать он будет уже иначе.

 

 

(Слева направо)

Фрэнсис Арнольд. Инженер-химик, профессор Калифонийского технологического института (США). Сначала Фрэнсис получила степень бакалавра в области механики и аэрокосмической техники в Принстонском университете. Лишь после получения докторской степени в Калифорнийском университете в 1985 году начала заниматься биохимией.

 

Джордж Смит. Американский химик, профессор университета Миссури. Выпускник Гарвардского университета свою работу, которая в итоге привела его к Нобелевской премии, начал в 1983 году в Университете Дюка.

 

Грегори Уинтер. Профессор Кембриджского университета (Великобритания). Учёную степень получил в Тринити-колледже в Кембридже. Известен, прежде всего, в связи со своими работами по терапевтическому применению моноклональных антител — белков, распознающих и разрушающих чужеродные белки.

 

Узнать последовательность аминокислот сегодня не проблема. Есть методы, позволяющие «читать» сам белок, есть методы, которые «читают» ген, ведь аминокислотная последовательность всех белков закодирована в генах, то есть в ДНК. И если мы знаем последовательность аминокислот, знаем, как аминокислоты взаимодействуют между собой, как они сворачивают полипептидную цепочку в трёхмерную структуру, то почему бы не отредактировать её так, чтобы получить белок с нужной функцией? Проблема здесь в том, что часто бывает невозможно в точности предсказать, что получится, если поменять одну аминокислоту на другую. Мы знаем, где в белковой молекуле нужно менять аминокислоты, чтобы изменить функцию, но далеко не всегда знаем, как именно их менять, чтобы получить то, что нам нужно. И вот тут на помощь приходит эволюция в пробирке.
 

Но ферменты — не кролики. Сначала надо синтезировать много-много молекул, отличающихся друг от друга мутациями, затем выбрать из них те, которые лучше всего «проводят» нужную нам химическую реакцию, внести в них новые мутации и затем снова выбрать уже лучшие из лучших, и т. д. С кроликами мы полагаемся на естественную изменчивость, которая неизбежно возникает в каждом поколении. В случае ферментов мы создаём её сами.

 

В общих чертах такую направленную эволюцию впервые описал выдающийся немецкий физикохимик Манфред Эйген в 1984 году. Однако в молекулярной биологии подчас важно не столько выдвинуть идею, сколько понять, как эту идею реализовать. Спустя десять лет направленную эволюцию ферментов на практике осуществили Фрэнсис Арнольд и её коллеги, экспериментировавшие с ферментом субтилизином. Он расщепляет молочный белок казеин; реакция, как и у всех ферментов, идёт в воде. Идея была заставить субтилизин работать не в воде, а в органическом растворителе диметилформамиде.

 

Арнольд и её коллеги вносили в ген суб- тилизина случайные мутации и вводили мутантные гены в бактерии. Бактерии син-тезировали мутантные белки, способные расщеплять казеин в растворе с диметил- формамидом. Некоторые мутанты делали это лучше других, и их тогда мутировали ещё раз и ещё. В результате через четыре «поколения» ферментов удалось получить вариант субтилизина, который работал в шестидесятипроцентном диметилформа- миде. Исходный фермент отчасти тоже мог расщеплять казеин в таких нестандартных условиях, однако новый фермент выполнял реакцию в 256 раз эффективнее.

 

Как создают разнообразную популяцию белков? Методы генетической инженерии позволяют быстро получить огромное количество копий любого фрагмента ДНК — был бы шаблон, с которого их можно копировать. При этом в новые копии можно либо сразу заложить какие-то конкретные ошибки, либо же ошибки будут появляться спонтанно и в разных местах. Вариантов должно быть очень много, чтобы было из чего выбирать. Довольно много усилий было потрачено на то, чтобы повысить изменчивость в популяции ферментов. Важный шаг здесь сделал голландский исследователь Виллем Штеммер — он бы, наверное, тоже получил свою часть нынешней премии, если бы не умер в 2013 году. Штеммер ввёл в искусственную эволюцию ферментов ещё один природный процесс — перетасовку фрагментов ДНК между генами. У нас такая перетасовка происходит при формировании половых клеток: разные варианты одного и того же гена, обмениваясь собственными фрагментами, получают друг от друга те или иные мутации. Таким образом повышается изменчивость белков, и среди них появляются такие, которые объединяют в себе сразу несколько мутационных «плюсов». Штеммер организовал то же самое при отборе ферментов: в пробирке плавало множество кусков ДНК (они кодировали один и тот же белок, но их взяли из разных организмов, в частности, из разных видов бактерий), и эти куски с помощью специальных ферментов постоянно соединялись друг с другом в разных комбинациях. Позже возникли и другие методы, помогающие получить как можно больше разнообразных вариантов белков. Получившиеся химерные и мутантные гены вставляли в геном бактерий, которые синтезировали ферменты.

 

Субтилизин, работающий в органическом растворителе, продемонстрировал, что направленная эволюция позволяет делать с белками просто невероятные вещи, а развитие генетической инженерии позволило эти невероятные вещи воплотить в жизнь. Ферменты приучают работать с новыми субстратами и в разных физических и химических условиях.

 

В качестве характерного примера можно привести цитохром С из бактерии Rho- dothermus marinus. Этот белок, который работает переносчиком электронов в окислительно-восстановительных реакциях, научили соединять углерод с кремнием. Кремнийорганические соединения чрезвычайно востребованы в современной химической промышленности, однако ни один природный фермент не был способен создавать связи между С и Si — до тех пор, пока Арнольд с коллегами не взялась за цитохром С.
 

Вообще на счету Фрэнсис Арнольд и её лаборатории уже масса белков, выполняющих самые разные химические реакции, которые не встречаются в природе, но без которых не может обойтись, например, фармацевтическая промышленность и другие (био)химические отрасли. Среди белков, получаемых методом направленной эволюции, есть и усилители вкуса, и лекарства от диабета и атеросклероза,и детергенты, которые получают в промышленных масштабах, и многое другое.

 

История открытий, за которые дали вторую часть премии, тоже берёт начало в первой половине 1980-х годов. В то время перед молекулярной биологией стояла серьёзная задача: как для конкретного белка найти его ген. С одной стороны, определение последовательности аминокислот в белке, особенно в большом белке, было ещё довольно сложной задачей; с другой стороны, такой же сложной задачей оставалось чтение ДНК — а ведь для того чтобы найти ген для белка, нужно было бы читать весь геном. Фаговый дисплей, придуманный вторым нынешним лауреатом, американским химиком Джорджем Смитом и его коллегами, как раз эту проблему решал. Суть его в следующем: представим, что у нас есть очень, очень большой кусок ДНК человека, в котором где-то прячется ген определённого пищеварительного фермента. Мы нарезаем этот кусок ДНК на множество небольших фрагментов, внедряем их в геном вируса-бактериофага и такой модифицированный вирусный геном запускаем в бактерии. Фаг начинает размножаться, и у нас получается фаговая библиотека: множество вирусных частиц с различными фрагментами интересующей нас ДНК.

 

 

Но ДНК мы встраивали не абы куда, а в определённое место — в ген белка вирусной оболочки. Вирус, размножаясь в клетке, заставляет её синтезировать его белки, из которых потом собирается вирусная частица. Если в белке оболочки есть фрагмент нашей ДНК, то белок получится гибридным — в него будет встроено что- то, закодированное этим фрагментом, и это что-то будет торчать на поверхности вирусной частицы.

 

Пора вспомнить, что мы ищем ген для пищеварительного фермента. Добавим к фаговым частицам какое-нибудь вещество, похожее на то, с которым работает наш фермент, причём способное связывать этот фермент. С ним свяжутся только те фаговые частицы, к которым в геном попал ген нашего фермента. Мы этих фагов очистим от всех прочих, прочитаем их небольшую ДНК и узнаем, что за ген кодирует этот фермент. То есть фаг нам показал соответствие между геном и белком — потому метод и назвали фаговым дисплеем.

 

Разумеется, сейчас для таких целей есть уже гораздо более эффективные методы. Однако карьера фагового дисплея начала бурно развиваться в ином направлении. Огромное количество белков заняты тем, что они постоянно с чем-то взаимодействуют. Первое, что приходит на ум в качестве примера, это белок-рецептор и его лиганды, то есть молекулы, которые с этим рецептором взаимодействуют; причём лигандами к рецептору могут быть опять же какие-то белки. Второе — это антитела, или белки иммуноглобулины, которые очень специфично хватают разные другие молекулы, делая их «видимыми» для иммунных клеток. Но белки узнают друг друга не целиком, а только некоторые небольшие части в молекуле партнёра. Например, многие антитела узнают тех, с кем они взаимодействуют, по отрезку длиной всего 5—6 аминокислот. Притом часто мы довольно приблизительно представляем, какие именно фрагменты в белковых молекулах более всего важны для взаимного распознавания и связывания.

 

Фаговый дисплей как раз стал методом, который позволяет узнать это не приблизительно, а точно. Например, чтобы понять, как именно антитела узнают определённый белок, мы берём антитела и сажаем их на какой-то неподвижный субстрат, после чего добавляем к ним разные фаговые частицы. В геном фаговых частиц мы заранее вставляем фрагменты ДНК, кодирующие кусочки белка, за которые, как мы предполагаем, антитела этот белок и хватают. Смывая фаговые частицы с антител, мы видим, какие из них держатся прочнее, а какие слабее. В тех, которые держатся прочнее, читаем ДНК и узнаём, какой именно фрагмент в белке антитела «любят» больше прочих. Причём может оказаться так, что антитела связывают этот фрагмент недостаточно прочно, и тогда надо искать, что можно присоединить к нему из исходной белковой молекулы, чтобы получить настоящее взаимодействие между антителами и белком.

 

Возможен и другой подход: взять какой- нибудь белок, разбить его на множество небольших перекрывающихся и непере- крывающихся фрагментов и распределить их по фагам. И дальше, выращивая урожаи фагов с тем или иным фрагментом, можно проверить, как с этим белком взаимодействуют антитела, рецепторы, ферменты и т. д. и т. п. Поскольку все процессы в клетке начинаются с взаимодействия одних молекул с другими, легко понять, сколь огромные перспективы открыли в биологии фаговый дисплей и подобные ему методы. Появились огромные библиотеки, состоящие из десятков миллионов коротких пептидов, по 6, 10, 15 аминокислот, которые были заключены в фаговых геномах и с которыми можно было делать всё что угодно.

 

Третий лауреат — профессор Кембриджского университета Грегори Уинтер — предложил достаточно простую идею: поменять в фаговом дисплее местами антитела и белки, которые они связывают. То есть теперь фаги должны были держать на своей поверхности разные варианты антител. Правда, иммуноглобулины — это очень большие и сложные белки, состоящие из четырёх полипептидных цепей, но за распознавание других молекул у них отвечает достаточно небольшой фрагмент, который вполне может уместиться на поверхности фага и ДНК которого вполне возможно уместить в геноме вируса.

 

Как известно, против одной и той же молекулы иммунная система синтезирует разный набор антител: из-за различий в центрах распознавания и связывания некоторые антитела связывают один и тот же белок хуже, чем другие. Постепенно за счёт отбора остаются только те, которые работают лучше всех. Фаговый дисплей позволяет сделать то же самое — выбрать из огромного количества вариантов иммуноглобулина тот, который лучше всего взаимодействует с нужным веществом.

 

Общая схема метода здесь та же самая, что и в направленной эволюции ферментов: ДНК, которая кодирует узнающую часть иммуноглобулина, синтезируют во множестве копий, а они в той или иной степени отличаются друг от друга. (Одна из библиотек, описанная ещё в 1991 году, состояла из 40 млн вариантов антител, с разной эффективностью взаимодейство- вавшихсодной итойжемолекулой.) После того, как мы выбираем лучшие антитела, можно продолжить их улучшение, так же мутируя их аминокислоты и отбирая новые, ещё более эффективные варианты.

 

Раньше были и другие методы лабораторной селекции антител, но фаговый дисплей оказался наиболее эффективным. С его помощью удалось решить несколько серьёзных проблем, которые преследовали всех, кто занимался иммунологией. Антитела получали, вводя животным разные вещества, но вещества эти могли оказаться токсичными, кроме того, сама иммунная система могла плохо реагировать на них. К тому же антитела, полученные в животных, порой просто невозможно было использовать в медицине: человеческий иммунитет воспринимал их как чужаков и уничтожал. Фаговый дисплей позволил создавать достаточно эффективные антитела к любым молекулам.

 

Иммуноглобулины, которые связываются только с определёнными молекулами, в современной биологии стали одним из главных исследовательских инструментов, а в медицине — одним из главных терапевтических средств. С их помощью можно не только подсмотреть, как клетки и молекулы взаимодействуют между собой, но и воспрепятствовать той или иной патологии. Сам Грегори Уинтер и его коллеги создали антитела против одного из иммунных сигнальных белков, который стимулирует воспаление. На основе этих антител в 2000-е годы появился первый «дисплейный» медицинский препарат, который назначают при ревматоидном артрите, псориазе, воспалительной болезни кишечника и прочих подобных болезнях.

 

Сейчас уже есть и другие антитела, созданные с помощью фагового дисплея и предназначенные и против инфекций, и против неинфекционных заболеваний, таких, как рак и болезнь Альцгеймера; некоторые из этих антител уже вошли в медицинскую практику, некоторые пока только проходят клинические испытания.

 

О фундаментальном и практическом значении открытий, сделанных лауреатами, можно говорить долго. Хотелось бы обратить внимание на другое. В каком-то смысле нынешнюю Нобелевскую премию по химии можно назвать одной из самых биологических, потому что она опирается на альфу и омегу биологической науки — на эволюционную теорию. Исключительно изощрённая химия понадобилась исследователям ради изменчивости и отбора, то есть ради того, что происходит во всём живом мире в ходе эволюции. В работах лауреатов мы видим характерный пример эволюционного мышления — оно не просто помогает отвлечённо осмыслять мир вокруг, но и приносит удивительные практические плоды.