Прогресс в редактировании ДНК

Исследование профессора Карлоса Барбаса III (Carlos Barbas III) (слева) и научного сотрудника его лаборатории Брайана Лэмба (Brian Lamb) открывает новые возможности в научных исследованиях и медицине. (Фото: TSRI)

Ученые из Исследовательского института Скриппса (The Scripps Research Institute, TSRI) нашли способ расширить сферу применения мощного метода редактирования ДНК, основанного на так называемых TALE-белках.

«Это один из самых известных инструментов в биологии, и теперь мы нашли способ сделать его мишенью любую последовательность ДНК», – говорит Карлос Ф. Барбас III (Carlos F. Barbas III), руководитель кафедры молекулярной биологии, профессор кафедры химии TSRI.

Прорыв касается ряда инженерных ДНК-связывающих белков, называемых TALEs, которые биологи все чаще используют для включения, выключения, удаления или даже переписывания конкретных генов для научных экспериментов, а также, потенциально, для биотехнологических и медицинских приложений, в том числе лечения генетических заболеваний.

Основанные на TALEs методы считаются эффективными только для части возможных последовательностей ДНК животных и растений, но теперь эти ограничения сняты. Профессор Барбас и его группа сообщают о своем открытии в журнале Nucleic Acids Research.

Молекулярные биологи давно мечтали о возможности манипулировать ДНК живых клеток с легкостью и точностью, и теперь эта мечта почти стала реальностью. Основанные на TALEs белки, разработанные всего несколько лет назад, возможно, самый удобный и точный из всех имеющихся на сегодняшний день инструментов для манипулирования ДНК.

Инженерные TALEs (transcription-activator-like effectors) основаны на природных TALE-белках, которые вырабатываются некоторыми бактериями, поражающими растения. Природные TALEs помогают бактериям использовать организм растения путем связывания с определенными сайтами растительной ДНК и повышения активности определенных генов, что способствует росту и выживаемости вторгшихся бактерий.

Ученые научились конструировать связывающийся с ДНК сегмент TALE-белков так, чтобы они взаимодействовали именно с нужной последовательностью ДНК. Обычно они присоединяют ДНК-связывающий сегмент к сегменту другого белка, который может выполнять определенную нужную функцию в нужном месте – например, к фрагменту фермента, разрезающего ДНК. В общей сложности лаборатории Барбаса и других ученых разработали уже тысячи таких мощных основанных на TALEs редактирующих ДНК белков.

Тем не менее основанное на TALEs редактирование ДНК имеет существенное ограничение. Мишенями практически всех открытых до сих пор природных TALEs являются последовательности ДНК, начинающиеся с нуклеозида тимидина, обозначаемого в четырехзначном ДНК-коде буквой «Т». Структурные исследования показали, что природные белки TALEs не могут связываться с ДНК без этого Т в начале последовательности, и молекулярные биологи считали, что правило «T-ограничения» применимо к любому инженерному TALE-белку.

«Однако никто не исследовал, действительно ли этот начальный тимидин необходим множеству существующих на сегодня искусственных TALE-белков и ферментов, с должной тщательностью», – говорит Брайан Лэмб (Brian Lamb), научный сотрудник лаборатории профессора Барбаса, первый автор статьи.

Лэмб начал с оценки того, насколько хорошо основанные на TALE белки функционируют с их обычными ДНК-мишенями, если первой буквой последовательности ДНК является не Т, а один из трех других нуклеозидов (A, G или C). Используя библиотеку природных и инженерных TALE-белков, он нашел веские свидетельства в пользу «T- ограничения».

«Активность TALE-белков отличалась на порядки – некоторые из оцененных нами TALEs теряли до 99,9% активности, если мы изменяли первое основание», – говорит Лэмб.

Но ученый не был готов отказаться от идеи создания TALE-белков с более широкими возможностями. Для этого он адаптировал метод «направленной эволюции», разработанный в прошлом году профессором Эндрю Мерсером (Andrew Mercer), в то время также научным сотрудником лаборатории Барбаса. Сначала Лэмб создал большую библиотеку новых TALE-белков, случайным образом отличающихся структурой, «захватывающей» начальный нуклеозид, а затем проверил новые TALEs в серии тестов, чтобы выбрать – в ускоренной версии естественной эволюции – те, которые работают адекватно даже с не-T нуклеозидом в начале их целевой ДНК-последовательности.

Так он нашел несколько новых TALEs, не подчиняющихся «Т-ограничению». Один из них предпочитает связываться с ДНК, начинающейся с гуанозина (G). Другие достаточно хорошо связываются c последовательностями, начинающимися с любого из четырех нуклеозидов. Кроме того, Лэмб убедился в том, что эти не ограниченные «Т-правилом» TALEs работают, как задумано, и будучи соединенными, например, с фрагментами разрезающих ДНК ферментов.

«По существу, мы отменили T-ограничение», – уверен ученый.

«Это означает, что количество сайтов ДНК, которые могут стать мишенями основанных на TALEs белков, и точность, с которой мы можем воздействовать на мишени в том или ином гене, значительно возросли», – говорит профессор Барбас.

Он и его группа планируют продолжить разработку потенциальных методов генной терапии, основанных на новых TALE-белках в качестве инструментов. Но снятие «T-ограничения» в редактировании ДНК должно оказать мощное влияние и на развитие молекулярной биологии, биотехнологий, методов лечения, основанных на стволовых клетках, и нанотехнологий, например, на создание ДНК-оригами. Практически выгоду от этого прорыва получает любая область, требующая манипуляций с ДНК – будь то в живых клетках или при конструировании основанных на белках и ДНК механизмов.

«Число потенциальных применений этой технологии, вероятно, больше, чем можно себе представить», – заключает профессор Барбас.

Источник