Новые технологии в области вакцин

Нобелевская премия по физиологии и медицине 2023 года присуждена Каталин Карико и Дрю Вайсману с формулировкой «за открытия в области модификации нуклеозидных оснований, позволившие создать эффективные мрНк-вакцины против COVID-19».

 

Можно сказать, что новые лауреаты удостоились премии за создание РНК-вакцин. Но это было бы не совсем точно. Сама идея таких вакцин возникла ещё в 80-е годы прошлого века, однако прежде чем они дошли до повседневной медицины, понадобилось решить ряд фундаментальных и практических задач. Чтобы понять, в чём суть нобелевских открытий Карико и Вайсмана, нужно вспомнить, что представляют собой РНК-вакцины.

 

Если совсем коротко, то смысл любой вакцины в том, чтобы натренировать имунную систему бороться с определенным патогеном — бактерией, вирусом, каким-нибудь вредным простейшим — до того, как этот патоген сам появится в организме. 

 

Известно, что иммунитет бывает врождённый и приобретённый, или адаптивный. Врождённый реагирует на угрозу очень быстро, но неспецифично. Он распознаёт молекулярные признаки, свойственные целому классу патогенов: той или иной группе бактерий, той или иной группе вирусов и т. д. Неспецифический ответ, при всей своей быстроте, не очень эффективен. Конфликт с инфекцией может продолжаться долго, ложась лишней нагрузкой на организм — иммунные реакции требуют много ресурсов и одновременно наносят сопутствующий вред здоровым тканям. Приобретённый иммунитет, наоборот, требует времени, чтобы включиться, но зато бьёт прицельно по конкретному патогену, например, по вирусу гриппа или по коронавирусу SARS-CoV-2. Включаясь позже, приобретённый иммунитет работает аккуратнее и быстрее; кроме того, он способен запоминать инфекции, с которыми сталкивался в прошлом. Для этого вакцина и нужна: записать в иммунную память молекулярный образ какого-то патогена. Когда знакомая бактерия или вирус появятся в организме, адаптивный иммунитет благодаря своей памяти мгновенно от них избавится, так что мы даже не почувствуем, что нас пытались атаковать. 

 

Вакцины бывают разные. Для простоты будем говорить о вирусах: чтобы иммунитет запомнил какой-то вирус, его нужно ослабить, и тогда у нас будет «живая» вакцина с ослабленным, или аттенуированным, вирусом. Однако с «живыми» вакцинами сохраняется ненулевая вероятность, что вирус в результате какой-нибудь мутации из ослабленного вернётся в нормальное (для себя) патогенное состояние. Вирус можно вовсе убить — тогда мы получим вакцину с инактивированным вирусом. Можно вообще обойтись без цельного вируса, ведь приобретённый иммунитет реагирует не на вирус как он есть, а на какие-то конкретные антигены, то есть иммуногенные молекулы. 

 

У вирусов это белки; значит, вакцина может содержать не весь вирус целиком, а только один его белок или фрагмент белка. Любой белок можно закодировать в ДНК или РНК — и получится генетическая вакцина. Правда, если ДНК или РНК будут просто плавать в крови или в межклеточном пространстве, то никакой пользы от них не будет — иммунитет не сможет узнать антигенный белок в закодированном виде. Необходимо, чтобы ДНК или РНК проникли в клетки, которые начнут синтезировать чужеродный белок и показывать его иммунной системе. Но большинство клеток просто так поглощать огромные нуклеиновые кислоты из внешней среды не будут, их нужно как-то доставить внутрь. Один из самых эффективных способов доставки — это модифицированные вирусы, или вирусные векторы. Модифицированный вирус не может размножаться, но у него остаётся способность работать с клеточными рецепторами и проникать в клетку. 

 

Нагруженный вакцинной ДНК, он не просто проведёт её сквозь наружную клеточную мембрану, он доставит её в ядро. Информация о белках сначала с ДНК копируется на матричную РНК, или мРНК, а с мРНК уже работают белоксинтезирующие машины. При этом копии мРНК на ДНК появляются в ядре, потом мРНК выходит из ядра в цитоплазму, и уже в цитоплазме на ней синтезируются белки. Поэтому вакцинную ДНК нужно доставить не просто в клетку, а в клеточное ядро. Можно упростить задачу и вводить в клетку матричную РНК, кодирующую вакцинный белок или фрагмент белка, — мРНК не нужно идти в ядро, она начнёт работать, оказавшись в цитоплазме. Однако для вакцинной мРНК специальная система доставки необходима в большей степени, чем для вакцинной ДНК, потому что РНК вообще менее устойчива и в тканях есть много ферментов, которые её расщепляют. Существуют методы, которые позволяют загнать в клетки голую мРНК, но мРНК в таких случаях нужно много, и вакцинирование в принципе оказывается малоэффективным. Так что обычно в РНК-вакцинах используют хитрости, которые маскируют мРНК от различных неприятностей. Это может быть тот же модифицированный вирус-«почтальон» или липидные наночастицы с мРНК-начинкой: соединяясь с клеточной мембраной, они высвобождают мРНК в клетку.

 

 

У ДНК- и РНК-вакцин есть преимущества перед другими, и одно из самых главных преимуществ состоит в том, что они действуют на клеточный иммунитет. За адаптивный иммунитет и иммунную память отвечают Т- и В-лимфоциты и синтезируемые В-лимфоцитами антитела. Но при этом и врождённый, и адаптивный иммунитет делятся ещё на гуморальный и клеточный. Гуморальный — это макромолекулы, главным образом разнокалиберные иммунные белки;  они  растворены  в  жидкой  среде (лат. humor — жидкость), будь то кровь в кровеносных сосудах или межклеточная жидкость. Плавающие в крови антитела и производящие их В-клетки, как можно догадаться, это гуморальный адаптивный иммунитет. 

 

Клеточный же — это Т-лимфоциты: они, если можно так сказать, работают собственными руками, то есть своими мембранными рецепторами взаимодействуют с больными или здоровыми клетками, решая, что с ними делать.

 

 

Механизм действия РНК-вакцины. 

 

Матричная РНК, кодирующая вирусный белок, проникает в клетку с помощью липидных наночастиц-липосом. В клетке она выходит в цитоплазму, где её подхватывают рибосомы — молекулярные машины, синтезирующие белок в соответствии с последовательностью мРНК. Получившийся вирусный белок расщепляют на части другие молекулярные машины — протеасомы, специализирующиеся на разрушении ненужного и опасного клеточного мусора. После этого фрагменты расщеплённого белка садятся на сложные белковые комплексы, которые называются MHC — major histocompatibility complex, или главные комплексы гистосовместимости. Куски вакцинного белка соединяются с MHC в системе мембран эндоплазматической сети и отправляются к наружной мембране, заключённые в секреторные пузырьки-везикулы. Снаружи Т-лимфоциты ощупывают своими рецепторами комплексы MHC с кусками чужеродного белка. Обычные клетки располагают MHC-комплексами только одной разновидности (I класса) и могут показать вирусный белок только цитотоксическим Т-лимфоцитам, которые непосредственно борются с инфекцией. Но есть специальные антигенпрезентирующие клетки — вроде дендритных иммунных клеток, у которых имеются MHC двух видов (I и II классов), и поэтому они показывают чужеродные молекулы не только цитотоксическим Т-лимфоцитам, но и Т-хелперам. Т-хелперы управляют активностью самых разных иммунных клеток и значительно усиливают их реакции, когда это нужно. Таким образом, попав в дендритные клетки, мРНК с вирусным белком не только стимулирует клеточный иммунитет, но и в целом усиливает иммунный ответ на вакцину.

 

Конечно, нужно иметь в виду, что и у Т-, и у В-лимфоцитов есть много разновидностей, что кроме антител, есть и другие белки, что клеточный иммунитет работает в теснейшем взаимодействии с гуморальным. Если глубоко погрузиться в сеть иммунных реакций и взаимных сигналов между клетками, может показаться, что деление на гуморальный и клеточный иммунитет выглядит несколько искусственным. Однако их отличия становятся видны, когда речь заходит об эффективности иммунного ответа и иммунной памяти.

 

Вирус и его обломки вполне могут плавать по крови, где с ними сложным образом взаимодействуют как В-лимфоциты, так и другие иммунные клетки. Цель этих взаимодействий в том, чтобы убедиться, что чужеродные молекулы действительно чужеродны и опасны, и чтобы из всего огромного набора антител, который потенциально есть в распоряжении у В-клеток, они начали синтезировать именно те, которые лучше подходят к вирусу. Антитела начнут налипать на вирус, обезвреживая его и привлекая к нему другие иммунные клетки и белки. Часть В-клеток надолго запомнят, какие антитела лучше всего подошли к вирусу, — на их память можно будет положиться, когда тот же самый вирус решит ещё раз нанести нам визит.

 

Однако основные события жизни вируса происходят внутри клеток: в них он размножается, производя новые вирусные частицы и тратя на это клеточные ресурсы. Клетки, разумеется, чувствуют, что в них живёт кто-то неприятный. Часть вирусных белков клетка успевает расщепить, после чего их фрагменты появляются на наружной клеточной мембране. Здесь на них натыкаются Т-лимфоциты: они «щупают» клетку своими рецепторами и, почувствовав на ней куски вирусных белков, понимают, что клетка больна. Происходит то, что называется презентацией антигена, после чего Т-лимфоциты начинают истреблять инфицированные клетки, координируя свои действия с В-лимфоцитами и другими иммунными клетками. При этом часть Т-лимфоцитов запоминает на будущее, какие именно чужеродные белки они видели. 

 

На самом деле всё происходит сложнее. Презентация антигена — процесс со многими действующими лицами: кроме обычных больных клеток, есть ещё специальные иммунные клетки из отдела врождённого иммунитета, которые тоже показывают своим коллегам куски чужеродных молекул. Для полноценной иммунной реакции должны активироваться и В-, и Т-клетки, а Т-клетки активируются в полной мере, если пообщаются не только с простыми больными клетками, но и с профессиональными антигенпрезентирующими «коллегами». Если речь идёт о настоящей инфекции, то всё так и произойдёт. А если речь о вакцинации? Если мы вакцинируемся убитым вирусом или отдельным вирусным белком, которые просто плавают в крови? 

 

Гуморальный иммунитет такие антигены почувствует, а вот клеточный — не очень. Конечно, иммунные клетки тесно сотрудничают. 

В какой-то мере клеточный иммунитет отреагирует и на такую вакцину, но реакция будет не очень сильной. Соответственно, не очень сильной окажется и иммунная память. Поэтому понятно, в чём преимущество ДНК- и РНК-вакцин: они дают возможность клеткам самим синтезировать вирусный вакцинный белок и показать его клеточному иммунитету. Какая-то часть вирусного белка окажется свободноплавающей, так что В-лимфоциты активируются тоже (плюс они опять же получат сигналы от других иммунных клеток). При этом у вакцин на нуклеиновых кислотах есть ещё некоторые сугубо технологические плюсы — ДНК и РНК проще синтезировать, и они не такие капризные в обращении, какими могут быть многие белки. Ну а про удачные особенности РНК-вакцин сказано выше: вакцинную мРНК не нужно доводить до клеточного ядра, и её можно сконструировать без оглядки на ядерные реакции — так, чтобы белоксинтезирующий аппарат в цитоплазме начал сразу синтезировать вакцинный белок и синтезировал его как можно больше.

 

 

Что нужно, чтобы сделать РНК-вакцину против вируса? Нужно знать, как он устроен, какой из его белков хорошо распознаётся иммунитетом. Нужна ДНК, кодирующая этот белок. Информацию с ДНК нужно скопировать в мРНК — это называется транскрипция. 
 

Транскрипцию нужно провести вне клетки, in vitro — то есть смешать в пробирке необходимые компоненты реакции и получить много мРНК. Всё это научились делать уже к концу 1980-х, и сама идея РНК-вакцин (как и ДНК-вакцин) витала в воздухе. Система доставки тоже уже была. Доставить мРНК в клетки с помощью липосом впервые удалось ещё в 1978 году. 

 

В  1993  году  в  «European  Journal  of Immunology» вышла статья с описанием первой липосомной РНК-вакцины против одного из вирусов гриппа. Вакцину испытывали на мышах, и испытания прошли успешно — мышиные Т-лимфоциты отреагировали на вирусный белок, синтезируемый клетками с вакцинной мРНК. Однако эти эксперименты показали лишь то, что такая вакцина в принципе способна работать. Чтобы войти в медицинскую практику, РНК-вакцины должны были быть не менее эффективны, чем ДНК-вакцины, которые активно разрабатывали в то же самое время. Собственно, ввиду невнятной эффективности РНК-вакцины долгое время оставались в тени ДНК-вакцин. 

 

И вот, наконец, настало время поговорить про исследования нынешних лауреатов — их работы во многом помогли сделать РНК-вакцины по-настоящему действенными. В конце 1990-х годов Карико и Вайсман начали работать с иммунными дендритными клетками. Выше говорилось, что больные клетки выставляют наружу чужеродные антигены, потому что болеют, потому что в них внутри поселился вирус. Но есть специальные иммунные антигенпрезентирующие клетки, которые намеренно ищут всё опасное, чтобы его особым образом переработать и показать другим иммунным клеткам. Дендритные клетки — одни из лучших антигенпрезентаторов. Пообщавшись с дендритными клетками, Т-лимфоциты начинают работать исключительно эффективно. 

 

Но те же дендритные клетки запускают защитные реакции из арсенала врождённого иммунитета: неважно, какой именно вирус или бактерия проникли в организм — необходимо оградить незаражённые ткани от заражённых, необходимо, чтобы заражённые клетки подавили в себе размножение патогенов и заодно как можно быстрее погибли вместе с ними.

 

У иммунных клеток (и не только иммунных) есть целый набор особых толл-подобных рецепторов (TLR — toll-like receptors), которые реагируют на общие молекулярные признаки бактерий, вирусов, эукариотических паразитов и пр. Есть TLR, взаимодействующие с фрагментами клеточной стенки бактерий, есть TLR, реагирующие на вирусную ДНК, есть TLR, реагирующие на вирусную РНК, и т. д. Причём TLR могут сидеть как на внешней мембране клетки, так и на внутренних мембранах, следя за тем, что появляется в клеточной цитоплазме. И вот Карико, Вайсман и их коллеги заметили, что in vitro синтезированная мРНК, попав в дендритные клетки, вызывает сильный неспецифический иммунный ответ. Внутренние TLR-рецепторы принимали её за какую-то инфекцию (и, в общем-то, были правы — любая вакцина в той или иной степени имитирует инфекцию). 

 

А если клетка инфицирована, то нужно подавить общий синтез белка, чтобы патоген не мог воспользоваться клеточными ресурсами, и нужно уничтожить саму мРНК. А заодно нужно запустить воспаление — неважно, что за инфекция тут у нас, важно, чтобы инфицированные клетки поскорее погибли. Всё это очень некстати, если мРНК — вакцинная: закодированного в ней белка получится очень мало и адаптивный клеточный иммунитет в лице Т-лимфоцитов не успеет с ним достаточно хорошо познакомиться. 

 

Какое-то время Карико и Вайсман изучали молекулярные реакции и сигнальные пути в иммунных клетках, возмущённых появле-

нием мРНК «из пробирки». В конце концов перед ними встал вопрос, почему клетки так на неё реагируют. Оказалось, что всё дело в модификациях, которых не было у мРНК, синтезированной in vitro. Любая РНК состоит из чередующихся азотистых оснований, соединённых химически с углеводом рибозой и остатком фосфорной кислоты (когда основание присоединяется к рибозе, получается нуклеозид, когда к нуклеозиду добавляется фосфорная кислота, получается нуклеотид, или нуклеотид монофосфат). Азотистые основания — это те самые четыре буквы генетического кода, чередование которых позволяет зашифровывать последовательность аминокислот в белках: аденин (А), гуанин (G),

 

цитозин (С), урацил (U). С середины прошлого века известно, что азотистые основания в РНК часто модифицированы: к ним химически присоединяется метильная группа или атом серы либо само основание иначе крепится к углеводу рибозе — сейчас известно более полутора сотен разного рода модификаций, и их список вряд ли полон. Какое-то время модифицированные основания видели только в служебных РНК, вроде транспортной РНК (тРНК) и рибосомной РНК (рРНК), без которых невозможен синтез белка. 

 

Потом оказалось, что и в матричных РНК сидят модифицированные основания. Далеко не каждое основание несёт модификацию, их вообще очень немного относительно всей молекулы мРНК, но всё же они есть. На генетический текст они не влияют, то есть во время синтеза белка обычное основание будет прочитано так же, как и модифицированное. Зато они помогают клетке отличать собственную мРНК от чужеродной. Этому и были посвящены нобелевские исследования Карико и Вайсмана: оказалось, что определённые модификации оснований прикрывают мРНК от внимания TLR-рецепторов. Тут нужно сказать, что многие вирусы тоже стараются обзавестись модификациями на своей РНК, чтобы обмануть иммунные рецепторы, и им это часто удаётся. Но, так или иначе, если нужных модификаций на мРНК нет, TLR-рецепторы дают сигнал, что в клетке завёлся кто-то чужой. Защитить синтезированную in vitro вакцинную мРНК можно, снабдив её «натуральными» модификациями на генетических буквах: в таком виде она перестанет провоцировать неспецифические врождённые реакции иммунитета и потому прослужит дольше.

 

 

Одна из многих химических модификаций на РНК: азотистое основание цитозин (слева) превращается в 5-метилцитозин — к углероду в пятом положении кольца присоединяется метильная группа H3C–. Все модификации происходят с РНК после её синтеза в ядре и до её выхода в цитоплазму. Модификации нужны не только для того, чтобы иммунитет мог отличить «свою» РНК от «чужой». Например, 5-метилцитозин повышает эффективность синтеза белка. У разных модификаций есть и другие функции, хотя в настоящее время не все они известны.

 

Иммунными отличиями дело не ограничивается. Те же Карико и Вайсман выяснили, что модификации делают молекулы мРНК более привлекательными для рибосом — огромных молекулярных машин, состоящих из рибосомных белков и рибосомных РНК. Рибосомы едут по мРНК, читая последовательность генетических букв в ней и синтезируя в соответствии с этой последовательностью белковую цепь. На мРНК с определёнными модификациями садится больше рибосом, чем на немодифицированные мРНК, так что и белка на модифицированных мРНК синтезируется больше. 

 

Подробный разбор того, как это происходит, увёл бы нас слишком далеко в молекулярные подробности. Так или иначе, Карико и Вайсман показали, как повысить эффективность  РНК-вакцин.  Несколько фармацевтических компаний начали всерьёз разрабатывать такие вакцины, причём речь шла не только о защите против инфекционных заболеваний, но и о том, чтобы с помощью РНК-вакцин стимулировать иммунный ответ против рака. И всё же, хотя статья об иммунозащитных свойствах РНК-модификаций была опубликована ещё в 2005 году, разработка и внедрение РНК-вакцин продвигались достаточно медленно. Понадобился «ковидный» импульс, чтобы РНК-вакцины вошли в медицинскую практику. Страх перед SARS-CoV-2 обеспечил ресурсами всех, кто занимался вакцинами, старыми или новыми. Антикоронавирусные РНК-вакцины быстро встали в строй с антикоронавирусными ДНК-вакцинами и более традиционными «белковыми» вакцинами, доказав свою действительную эффективность. И если этот импульс не иссякнет в скором времени, то РНК-вакцины ждёт славное будущее.