Новые способы репродукции

Мыши, снующие туда-сюда в одной из клеток в лаборатории Кацухико Хаяши (Katsuhiko Hayashi), не кажутся какими-то особенными. Они перемещаются, едят, спят так же, как тысячи их сородичей. Но история происхождения этих восьми грызунов, изложенная на страницах журнала Nature два года назад Кацухико Хаяши, специалистом по репродукции из Университета Кюсю в Японии, поистине уникальна. Рыжевато-коричневые зверьки появились на свет не в результате слияния материнских яйцеклеток с отцовскими спермиями. По материнской линии они восходят к перепрограммированным клеткам кожи.

 

Этот инновационный эксперимент принял эстафетную палочку от многообещающего события — клонирования овечки Долли в 1997 г., которое в свою очередь базировалось на более ранних — 1970-х гг. — работах по клонированию лягушек и предположении, что все животные клетки имеют одинаковый основной набор генетических инструкций. Последнее нашло подтверждение при клонировании Долли: ее создатели показали, что различие между клетками груди и клеткой любой другой ткани животного основывается на том, что в активном состоянии в них находятся разные гены.

 

Для Хаяши и других специалистов в области репродукции это открывало дорогу к перепрограммированию животных клеток с целью получения их них клеток любого типа — от нервных до яйцеклеток. Небольшое число биологов из самых разных стран, в том числе Хаяши, используют эту возможность для осуществления гаметогенеза in vitro — получения яйцеклеток и спермиев из клеток взрослого животного.

 

Специалисты в области репродукции совместно с несколькими семейными парами, борющимися с бесплодием, близки к тому, чтобы попытаться реализовать на практике успехи, достигнутые Хаяши и другими биологами по превращению стволовых клеток грызунов в рудиментарные спермии. Если будет показано, что такой подход применим к человеку, возможно, настанет день, когда дефектные гаметы уступят место полноценным половым клеткам, полученным на основе клеток крови или кожи. В этом прекрасном будущем мужчинам, страдающим бесплодием, не придется переживать по поводу своей неполноценности, а женщины, шансы которых стать матерью уменьшаются с возрастом, будут производить на свет здоровых младенцев. Однополые супружеские пары тоже смогут обзаводиться детьми, биологически связанными с обоими родителями.

 

Перспективы весьма заманчивые, но отдаленные. Многолетние эксперименты на животных, нацеленные на поиски полноценных заменителей яйцеклеток и спермиев, дающих начало большинству млекопитающих, практически завершены. Но даже эти опыты на мышах предвещают возникновение массы этических проблем, когда речь зайдет о применении инновационных репродуктивных технологий в медицине.

 

 

В поисках решения проблемы женского бесплодия Кацухико Хаяши с коллегами из Университета Кюсю в Японии пытаются найти способ превращения клеток кожи в жизнеспособные яйцеклетки. Проведя тысячи неудачных экспериментов, осенью 2016 г. ученые наконец-то подобрали подходящую культуральную среду — смесь неких химических веществ и специфических генов, в которой мышиные клетки кожи через ряд трансформаций превратились в жизнеспособные яйцеклетки. Оплодотворив их in vitro обычными спермиями и имплантировав в матку мыши, Хаяши получил восемь здоровых мышат. Есть надежда, что эта инновационная технология найдет применение в медицине.

 

 

Чтобы осуществить задуманное в опытах на мышах, Хаяши с сотрудниками понадобилось свести воедино несколько сделанных ранее открытий. В 2010 г. они пытались подрегулировать некий клеточный механизм, в результате чего клетка возвращается на стадию, предшествующую стадии дифференцировки. Для этого Хаяши с коллегами воспроизвели процесс, который разработал Шинья Яманака (Shinya Yamanaka) из Киотского университета (в 2012 г. за это изобретение ученый был удостоен Нобелевской премии).

 

Прежде всего они взяли соскоб клеток кожи хвоста взрослой мыши, а затем инъецировали в него коктейль из химических веществ, содержащий четыре специфических гена, с тем чтобы вернуть зрелые клетки в состояние, когда они были способны давать начало разнообразным дифференцированным клеткам (то есть получить стволовые клетки). Далее Хаяши с сотрудниками прибегли к генетическим манипуляциям, проделанным в начале 2000-х гг. Адзимом Сунари (Azim Sunari), работающим сегодня в Институте Гердона при Кембриджском университете, и Митинори Саитоу (Mitinori Saitou), бывшим сотрудником Сунари. Эти и другие эксперименты с эмбриональными клетками, полученными от обычного мышиного эмбриона, позволили Хаяши выяснить, какие гены необходимы для того, чтобы стволовые клетки дифференцировались с образованием зачатка половых клеток (примордиальных клеток).

 

Примордиальные клетки, из которых могли развиться яйцеклетки или спермии, имеют такой же набор хромосом, как любая животная клетка. Чтобы получить из них половые клетки, содержащие половинный набор генов по сравнению с соматическими клетками, нужно, чтобы они претерпели два мейотических деления. В женском организме первое такое деление происходит, когда примордиальная клетка попадает в репродуктивную систему. Второе деление приходится на стадию овуляции, когда в ооцит (предшественник яйцеклетки) проникает спермий. Если имплантировать примордиальные клетки 

в организм мыши, то они завершат свое развитие без всякого вмешательства экспериментатора. Но чтобы получить жизнеспособные яйцеклетки в чашке Петри, нужно воссоздать все этапы их созревания, которые они проходят in vivo.

 

Для этого следует максимально приблизить условия культивирования к естественным. Хаяши потребовалось несколько лет для подбора нужной культуральной среды. Успех пришел, когда в среду были добавлены клетки яичников плода другой мыши. Эти клетки экскретировали гормоны, благодаря чему имитировались условия, в которых происходит созревание in vivo. Кроме того, экспериментаторы изменили вязкость среды, что еще более приблизило ее к естественному окружению созревающих клеток.

Мыши, появившиеся на свет в результате оплодотворения яйцеклеток, полученных в лабораторных условиях, обычными спермиями (1). Эти яйцеклетки происходят от эмбриональных стволовых клеток (2).
 

Следующим шагом после получения полноценных яйцеклеток было оплодотворение in vitro. Сначала в среду со зрелыми яйцеклетками ввели спермии взрослого самца мыши. По прошествии нескольких суток из числа образовавшихся эмбрионов отобрали с помощью миниатюрной пипетки наиболее подходящие по ряду критериев и ввели их в матку мыши. После многих неудачных попыток получить потомство — безуспешной имплантации, преждевременных родов и по другим причинам — в конце концов на свет появился один здоровый детеныш. Начало было положено; следующие попытки оказались более успешными.

 

Однако метод все еще далек от совершенства. Только 16 из сотен полученных группой Хаяши стволовых клеток благополучно перенесли пятинедельный процесс созревания. А когда эти выращенные в лаборатории яйцеклетки соединили со спермиями и имплантировали их в матку мыши, получили лишь крайне малый процент здоровых мышат; при оплодотворении in vitro (IVF, in vitro fertilization) этот процент составляет 62. И все же было доказано, что метод работает. Появившиеся на свет восемь детенышей выросли в полноценных взрослых особей, которые дали нормальное потомство.

 

 

В репродуктивной помощи нуждается множество людей. 10% жителей США мужского пола и примерно столько же женского бесплодны. Попытки преодолеть это состояние сопряжены со сложными манипуляциями и часто не дают желаемого результата. Так, необходимое условие успеха IVF — прием женщиной гормонов в течение однойдвух недель для стимуляции образования яйцеклеток. Последние будут оплодотворены in vitro, и одна-две — имплантированы в матку. Стоимость всей процедуры достигает $20 тыс., и при этом в 65% случаев результат оказывается неутешительным, в основном из-за некачественной яйцеклетки.

 

Отсюда ясно, почему перспектива использования клеток крови или кожи пациента для получения потомства представляется столь заманчивой. Вместо того чтобы экстрагировать яйцеклетки из матки потенциальной матери, достаточно взять у нее пробу крови.

 

Клетки крови перепрограммируют в стволовые клетки, а затем получают из них яйцеклетки или спермии. Яйцеклетку оплодотворяют спермой и имплантируют в матку женщины таким же способом, как при IVF. В результате ребенок наследует генетический материал отца и матери — как это было бы при нормальном оплодотворении. Как утверждает Хаяши, пока эта процедура слишком рискованна, чтобы применять ее к человеку, и станет доступной, только если яйцеклетки, создаваемые в лаборатории, смогут давать начало зародышу с такой же вероятностью, с какой это происходит естественным путем. Для начала нужно убедиться, что яйцеклетки остаются жизнеспособными в лабораторных условиях достаточно долгое время. (Мышиные яйцеклетки созревают за пять суток, а человеческие — примерно за 30.) И прежде чем приступать к применению подхода в медицине, необходимо апробировать его на более крупных животных, чем мыши.

 

 

Хаяши с коллегами уже занимаются таким тестированием на приматах, а именно — обезьянах игрунках. Правда, эти исследования затруднены по ряду причин. Мыши — оптимальный объект для тестирования многих инновационных технологий, поскольку овуляция у них происходит каждые пять дней, а беременность длится 20 дней. У игрунок этот период составляет более 140 дней, так что рождения детенышей приходится ждать гораздо дольше, даже если все манипуляции были удачными. Созревание предшественников яйцеклеток у игрунок тоже занимает гораздо больше времени, чем у мышей, и чтобы процесс протекал успешно, нужно подобрать оптимальные средовые условия.

 

Многолетние опыты на мышах позволили выяснить, как создать условия для созревания вне тела животного, но для завершения процесса попрежнему нужны клетки яичников плода. Хаяши с коллегами пришли к выводу, что для созревания in vitro недостаточно просто внести в культуральную среду клетки яичников. Нужно отобрать и использовать те из них, которые посылают сигналы к созреванию, и научиться получать такие клетки из стволовых. В таком случае экспериментатор сможет самостоятельно выращивать все необходимые ингредиенты и не ждать, когда появится возможность взять какие-то из них от плода другой мыши.

 

Сунари, пионер в области исследований клеток зародышевой линии, проводил эксперименты с разными комбинациями этих ключевых хелперных клеток, способствующих созреванию зародышевых клеток и их коммуникации. «Зародышевые клетки в своем развитии доходят до некоей рубежной точки, и чтобы пройти ее, нужен сигнал или какое-то изменение в культуральной среде», — поясняет он. У Сунари и его коллег есть разумное предположение относительно того, какие клетки могут быть особенно значимыми для этого процесса, но чтобы идентифицировать их, нужна долгая кропотливая работа. 

 

Сейчас они исследуют в поисках таких клеток абортированный плод человека и проводят эксперименты не на приматах, а на свиньях, поскольку развитие зародышей последних ближе к таковому у человека, а кроме того, экспериментирование на них обходится дешевле, чем на обезьянах.

 

Некоторые исследователи полагают, что для достижения желаемого результата следует как можно скорее помещать полученные in vitro клетки в естественные для них условия, то есть в организм лабораторного животного с его естественной системой контроля качества. Рене Рейхо Пера (Renee Reijo Pera), специалист по стволовым клеткам из Университета штата Монтана, использует такой подход в работе со спермиями. В естественных условиях из всего их огромного количества выживают до момента оплодотворения яйцеклетки только самые «качественные», в опытах же in vitro никакого контроля качества не существует, и высока вероятность того, что оплодотворение осуществит дефектный спермий. «Организм человека сразу отторгает некачественные спермии, — говорит Пера. — А проводя все процессы в чашке Петри, мы не можем обеспечить нужный контроль».

 

Скептики уверены, что, несмотря на все старания специалистов по репродукции, искусственные яйцеклетки или спермии никогда не найдут применения в качестве необходимых компонентов зарождения человеческой жизни. Так, Марси Дарновски (Marcy Darnovsky) считает, что полученные в лаборатории зародышевые клетки не будут полноценными настолько, чтобы риск их применения был равен нулю. Дарновски — исполнительный директор Центра генетики и человеческого сообщества, задача которого состоит в повышении ответственности при использовании генетических манипуляций в медицине. 

 

Она целиком и полностью за исследования, позволяющие полнее понять процессы развития человека и животных, но против применения искусственно созданных яйцеклеток и спермиев для получения живых существ, особенно если речь идет о человеке. «Я думаю, жизнь любого появившегося таким способом на свет ребенка находится под угрозой», — говорит Дарновски, ссылаясь на опыт клонирования млекопитающих: многие полученные искусственным путем эмбрионы вообще не развивались, а немногочисленные более успешные имели серьезные отклонения, несовместимые с жизнью. 

 

Дарновски уверена, что эксперименты, проводимые Хаяши, Сунари, Пера, не зайдут слишком далеко, если будут находиться под пристальным вниманием общественности. Есть и другой аспект новой репродукционной технологии, вызывающий беспокойство. Если из зрелых соматических клеток одного человека можно будет получать и яйцеклетки, и спермии, не случится ли, что наступит эпоха «безотцовщины»? 

 

А может быть, кому-то взбредет в голову собрать клетки кожи с носового платка или нижнего белья некоего человека и использовать их для создания ребенка — и все это без ведома хозяина (или хозяйки) этих клеток? Дальше — больше. Джордж Дэли (George Daley), декан одного из факультетов Медицинской школы Гарвардского университета, описывает в статье Science Translational Medicine ситуацию, когда новые биотехнологии позволяют создавать эмбрионов в непредставимых ранее масштабах, что приводит к обесцениванию человеческой жизни и порождает новые социальные проблемы.

 

До сих пор этические нормы ограничивали исследования в области репродукции человека, в частности связанные с получением гамет in vitro, и сводили к минимуму их финансирование. Бывший президент США Барак Обама относился к экспериментам со стволовыми клетками более благосклонно, чем его предшественники, при которых такие работы были строго ограничены. Но с приходом новой администрации маятник может качнуться в противоположную сторону. В других странах недостаточное финансирование и ограничения, налагаемые на получение образцов тканей человеческих эмбрионов, тоже сужают возможности исследователей, в частности Сурани и Хелен Пиктон (Helen Picton), которые занимаются аналогичными экспериментами в Лидском университете в Англии. А по словам Хаяши, ему было бы очень трудно работать со стволовыми клетками у себя на родине, в Японии, где закон запрещает проводить оплодотворение с помощью полученных в лабораториях спермиев даже в научных целях. В то же время, по словам Якоба Ханны (Jacob Hanna) из Института им. Вейцмана в Реховоте (Израиль), работающего со стволовыми клетками, сейчас для него наступают золотые времена благодаря интересу общественности к репродуктивным технологиям.

 

 

Даже если все описанные инновации в области репродукции не приведут к созданию полноценного дитяти человеческого, эксперименты с «изготовлением» яйцеклеток и спермиев не прекратятся ввиду их научной и медицинской ценности. Речь идет о борьбе с бесплодием, исследовании самых ранних этапов развития человека, выяснении влияния токсинов на наследственность и о многомдругом. «Это сродни великим географическим открытиям», — говорит Пиктон. Так, научившись идентифицировать качественные яйцеклетки и спермии, мы сможем достичь большего прогресса в IVF. А разработав способ получения гамет, сделаем первый шаг к выявлению того момента во внутриклеточных процессах, когда произошел сбой, приведший впоследствии к тем или иным болезням, врожденным дефектам или гибели клеток.

 

Эксперименты с получением яйцеклеток и спермиев из клеток кожи или крови помогут разобраться также в относительно недавно обнаруженном феномене — эпигенетическом наследовании. Поняв с самого начала до конца, как образуются спермии и яйцеклетки, мы сможем устранять метильные группы или другие эпигенетические метки, приводящие к нежелательным последствиям. Сейчас на повестке дня стоит вопрос, каким образом некоторые приобретенные признаки передаются через поколения. Исследование, проведенное в 2016 г., показало, что эпигенетические изменения в генах, связанных с регуляцией выработки гормонов стресса, обнаруживаются у потомков людей, переживших холокост, при том что эти потомки родились спустя многие годы после трагических событий. Сами эти гены не изменились, изменилось их поведение. По мнению Сурани, объяснить этот феномен, а также пролить свет на причины старения позволят опыты по созданию спермиев и яйцеклеток из стволовых клеток.

 

В настоящее время Сурани занимается выяснением того, что происходит с митохондриями в процессе получения яйцеклеток. При репродукции эти «энергетические фабрики» клеток претерпевают некую селекцию, так что потомок получает только материнскую митохондриальную ДНК. Процесс коррекции митохондрий изучен недостаточно хорошо, но Сурани надеется, что исследование механизма устранения ошибок в клетках зародышевой линии позволит многое узнать о нарушениях «энергоснабжения» клеток и связанных с этим заболеваниях. «Со временем мы соберем достаточное количество информации, чтобы использовать ее для поддержания здоровья человеческой по пуляции», — заявляет он.

 

Хаяши считает, что инновационные репродуктивные методы помогут спасать виды живых существ, находящихся на грани исчезновения. Сам он пытается воспроизвести свои эксперименты на мышах на клетках одного из таких животных — белого носорога. Успехи пока невелики, и дело не только в различиях репродуктивных процессов у этих двух видов, но и в том, что результатов приходится ждать гораздо дольше. У мышей беременность длится 20 дней, а у носорогов — более 16 месяцев.

 

Исследования Хаяши, связанные с белым носорогом, вызывают большой интерес и одобрение общественности, однако настроение радикально изменяется, когда речь заходит о человеке: «Одни проявляют скептицизм, других такие попытки пугают», — говорит он. Эти настроения вполне объяснимы. Хаяши осознает, что прежде чем удастся трансформировать человеческие клетки в жизнеспособные яйцеклетки или спермии, будет безрезультатно израсходовано огромное количество клеток зародышевой линии человека. Но даже жизнеспособные гаметы могут дать начало дефектному эмбриону.

 

Рейхо Пера считает, что этические соображения не должны сдерживать развитие инновационных методов репродукции, поскольку их предназначение — поддерживать прогресс в этой области. Например, излечившиеся онкологические больные часто бывают бесплодными, и единственный способ для них стать отцом или матерью — прибегнуть к таким инновациям.

 

Остается нерешенной масса вопросов по поводу того, что считать безопасным и кто это будет решать. Когда появились другие вызывающие споры технологии, например IVF и система редактирования генов CRISPR, многочисленные дискуссии с участием их разработчиков, специалистов по этике и представителей общественности позволили сформулировать четкие рекомендации по их применению. Скорее всего нечто подобное произойдет и в отношении гаметогенеза in vitro. И такие дискуссии должны стартовать задолго до того, как начнется применение этих технологий в медицине. «Чтобы не быть застигнутым врасплох, общество должно выработать консенсус по поводу этичности гаметогенеза in vitro и быть готовым отстаивать свою позицию, — пишут Дэли с коллегами в статье, опубликованной в январе 2017 г. — При той головокружительной быстроте, с которой развиваются наука и медицина, репродуктивная и регенерационная технологии могут преподнести нам множество сюрпризов».